Jednou z dominant a vzácných památek zámeckého vrchu je gotický trojlodní kostel sv. Václava s věží umístěnou na jižní straně presbytáře. Do jeho oratoře měla šlechta přístup přímo ze zámku.
Přes různé úpravy a dostavby si stavba v Mikulově dodnes zachovala gotický vzhled, zejména v presbyterní části, zaklenuté síťovou a částečně také hvězdicovou klenbou. Z vnější strany připomínají gotické období bosáž a opěráky. Klenby trojlodí jsou pokryty bohatou manýristickou štukaturou. Barokní výzdoba kostela je dílem sochařů O. Schweigla, I. Legelachera, malíře J. F. Adolfa a dalších. Od velkého požáru roku 1784 je v boční loretánské kapli uctívána milostná socha černé loretánské madony. Význam kostela, do jehož oratoře měla šlechta přístup přímo ze zámku, stoupl poté, co při něm byla kardinálem Dietrichsteinem roku 1625 zřízena význačná kolegiátní kapitula. Jako proboštský chrám slouží kostel sv. Václava dosud.

Dnešní kostel sv. Václava je situován v prostoru původní vsi, která se později stala součástí Mikulova. Existenci románského kostela na témže místě můžeme předpokládat již na konci 12. století, písemně doložen je však až do roku 1276. Původní podobu kostela neznáme. Dnešní stavba pochází v jádře z počátku 15. století a podílel se na ní parléřovsky orientovaný stavebník. Dokončení výstavby kostela násilně přerušil husitský vpád do města v roce 1426, kdy došlo k vypálení a zničení novostavby. Po dlouhou dobu byl kostel jen provizorně opraven, v roce 1584 znovu vyhořel. O rok později, již za Dietrichsteinů, významných představitelů rekatolizace, byla zvýšena věž kostela o obytné patro s bytem věžníka a arkádovým ochozem.
K dokončení stavby došlo až kolem roku 1640 novým zaklenutím trojlodí s novou štukovou výzdobou. Přistavěna byla sakristie s hudební kruchtou v patře a upravena byla do dnešní podoby gotická okna. K bokům trojlodí byly přistavěny mariánské kaple a panská oratoř s krytou chodbou, vedoucí k cestě do zámku.

Z vnitřní výbavy je nutné zmínit hlavní oltář s monumentálním obrazem Zavraždění sv. Václava od Františka Antona z Freenthalu a hlavně sošku Madony s dítětem z cedrového dřeva v oltáři v severní kapli Panny Marie loretánské, původně umístěnou v loretánském kostele sv. Anny. V severní nice kněžiště byly po roce 1784 instalovány mramorové epitafy Václava Viléma Popela z Lobkovic (+1626) a jeho manželky Markéty Františky, rozené z Dietrichsteina (+1617), s portréty zemřelých. Řada náhrobků, pocházejících z druhé poloviny 16. a první poloviny 17. století, je umístěna na vnější zdi kostela.